Методология флоуметрии, 1999 г. стр.167-179.

Исследование реакций изолированных сосудов на раздражение симпатических нервов

А.С.Боровик, В.О.Голубинская, О.С.Тарасова, И.М.Родионов

Лаборатория кибернетики института хирургии им. А.В. Вишневского РАМН, кафедра физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Одним из важных звеньев регуляции тонуса кровеносных сосудов симпатической нервной системой является преобразование нейрогенных управляющих сигналов в сократительные ответы гладких мышц сосудов. Нами разработана методика, позволяющая исследовать механизмы этого преобразования в опытах на одиночных изолированных сосудах. Такие исследования могут дать ответ на вопрос о том, как различаются реакции сосудов на действие различных последовательностей управляющих импульсов, определить временные и частотные характеристики нервно-мышечной симпатической передачи. Следует отметить, что обычно измерение сократительных ответов сосудистой стенки проводят в изометрических условиях, т.е. в условиях, когда сокращение гладкомышечных клеток не сопровождается их укорочением [1, 6, 8]. В наших же экспериментах измерения проводятся в режиме стабилизированного давления, который лучше моделирует условия in vivo.

Поток, протекающий через исследуемый сосуд, регистрируется с помощью флоуметра T106 типа transit-time (Transonic Systems Inc., USA). Для перфузии используется солевой раствор, тем самым исключается действие содержащихся в крови многочисленных вазомоторных факторов, которое затрудняет анализ механизмов симпатического влияния на сосуды.

Объектами исследования служат выделенные из крыс артерии мышечного типа: хвостовая артерия, подкожная артерия и артерии брыжейки первого порядка ветвления (диаметром около 300 мкм). В стенках этих сосудов имеется множество окончаний симпатических нервов [1, 5], что позволяет наблюдать выраженные нейрогенные констрикторные ответы.

Материалы и методы

В опытах использовали крыс линии Вистар весом 200-300 г. Животных декапитировали, осторожно извлекали вентральную хвостовую артерию, подкожную артерию или участок кишечника длиной 10-12 см с брыжейкой и помещали объект в чашку Петри, заполненную холодным (4^oС) раствором Кребса-Хенселейта, содержащим (мМ): NaCl 122,2, KCl 6,67, CaCl₂ 2,5, Mg₂SO₄ 1,25, NaHCO₃ 25,0, KH₂PO₄ 1,18, D-глюкоза 8,0. Раствор аэрировали смесью 96% O₂ + 4% CO₂, pH был равен 7,35 - 7,4. Исследуемые сосуды (вентральную хвостовую артерию, подкожную артерию или артерию 1-го порядка ветвления верхней брыжеечной артерии) отделяли от окружающих тканей, затем из препарата вырезали цилиндрический сегмент длиной 7-10 мм для хвостовой артерии и 5-7 мм для брыжеечной артерии и подкожной артерии. Полученный сегмент переносили в экспериментальную камеру, заполненную холодным раствором Кребса-Хенселейта. Расположив камеру под бинокулярной лупой, оба конца сосуда вставляли канюли. Затем канюли раздвигали и фиксировали их в таком положении, чтобы препарат был растянут приблизительно до длины in situ.

Рисунок 1. Схема экспериментальной установки для перфузии изолированных сосудов в режиме стабилизированного давления и электрической стимуляции интрамуральных симпатических нервов.
1 - емкость с перфузионным раствором; 2 - датчик давления; 3 - проточный датчик флоуметра; 4 - флоуметр; 5 - электростимулятор; 6 - стимулирующие электроды; 7 - компьютер с АЦП.

Схема экспериментальной установки представлена на рис. 1. Для перфузии и суперфузии сосуда также использовали раствор Кребса-Хенселейта, который нагревали до 37^oС. Раствор в перфузионной камере непрерывно сменяли со скоростью 4 мл/мин. Перфузию сосудов проводили в режиме постоянного давления. Давление на входе в сосуд создавали либо гидростатически, поднимая емкость с раствором на определенную высоту, либо с помощью сжатого воздуха, поддерживая его давление в содержащей раствор емкости на заданном уровне.

В начале каждого эксперимента исследуемый сосуд выдерживали в течение 30 мин при перфузионном давлении 60 мм рт.ст. (для хвостовой артерии) или 50мм рт.ст. (для более мелких сосудов), это приводило к полному расслаблению гладкой мышцы сосудистой стенки. При этом величины объемной скорости потока через сосуд были равны 4-6 мл/мин и 2-3 мл/мин, соответственно.

При перфузии в режиме стабилизированного давления сужение сосуда под действием констрикторных стимулов приводит к уменьшению потока раствора через сосуд. Для измерения объемной скорости тока перфузата использовали transit-time флоуметр T106. Проточный датчик (типа 1N) встраивали в перфузионную систему перед входной канюлей. Одновременно с измерением потока проводили измерение давления на входе в исследуемый сосуд.

Для раздражения интрамуральных симпатических нервов с обеих сторон сосуда в средней его части помещали электроды, изготовленные из платиновой проволоки диаметром 0,5 мм, так, чтобы электроды не касались препарата. Раздражение проводили прямоугольными импульсами тока с чередующейся сменой полярности, амплитудой ~ 200 мА и длительностью 0,2 мс. Сократительный ответ сосуда на электрическую стимуляцию полностью блокировался тетродотоксином (1 мкМ). Это свидетельствует о том, что электрические импульсы раздражали только интрамуральные нервы, но не гладкомышечные клетки сосуда. Таким образом, такая стимуляция дает возожность исследовать констрикторные ответы изолированных сосудов на раздражение симпатических нервов.

Регистрацию и обработку экспериментальных данных проводили на компьютере типа IBM PC с использованием прецизионного АЦП (L-card, Москва) и оригинального программного обеспечения. Одновременно с регистрацией данных в ходе эксперимента программа управляла работой электростимулятора, что позволяло проводить раздражение произвольной последовательностью импульсов.

Результаты

Целью проведенных экспериментов было определение "передаточной функции" нервно-мышечной симпатической передачи, то есть изучение того, как изменения частоты стимуляции ("вход" системы) влияют на изменения сосудистого тонуса ("выход"). Для решения этой задачи можно использовать два типа паттернов стимулирующих импульсов: а) последовательность импульсов с заданной средней частотой и мгновенной частотой, изменяющейся случайным образом (т.н. "белый шум"); б) последовательность импульсов с заданной средней частотой и мгновенной частотой, изменяющейся по синусоидальному закону.

Рисунок 2. Пример эксперимента на хвостовой артерии. Приведены записи потока через сосуд (А), частоты стимулирующих импульсов (Б) и перфузионного давления (В). Частота раздражения изменялась по Гауссовому закону (среднее значение 2 Гц, стандартное отклонение 0,5 Гц.

Рисунок 3. Результаты обработки эксперимента, приведенного на рис. 2. Изображены спектры мощности колебаний частоты стимуляции (А) и объемной скорости потока (Б) в диапазоне от 0,01 Гц до 0,5 Гц.

Пример эксперимента с использованием паттерна типа "белый шум" приведен на рис. 2. Средняя частота стимуляции составляла 2 Гц. В течение первой минуты импульсы следовали регулярно, это привело к уменьшению потока (перфузионное давление в течение этого периода и всего последующего эксперимента оставалось практически неизменным). Режим предварительной стимуляции необходим для "врабатывания" сосуда, в это время препарат приводится в новое состояние, отвечающее заданной средней частоте стимуляции. Затем автоматически "включалась" нерегулярная стимуляция. В этом эксперименте мгновенная частота стимуляции изменялась случайным образом по Гауссовому распределению. Сразу же после начала нерегулярной стимуляции появлялись флуктуации потока. Видно, что характер флуктуаций частоты стимуляции и потока различается. На рис. 3 приведены спектры мощности колебаний частоты стимуляции (А) и объемной скорости потока (Б) в диапазоне от 0,01 Гц до 0,5 Гц. Видно, что спектры мощности колебаний частоты стимуляции ("вход") и потока ("выход") значительно различаются. Высокочастотные колебания частоты стимуляции не передаются в колебания потока. Наиболее выраженные колебания потока наблюдаются при частоте ~0,05 Гц, то есть в данных условиях эксперимента эта частота стимуляции наиболее благоприятна для изменения тонуса сосудистой гладкой мышцы. Иными словами, при частоте ~0,05 Гц наблюдалось резонансное увеличение амплитуды колебаний потока.

Следует отметить, что описанный выше метод определения "передаточной функции" применим только для систем, обладающих свойством линейности [10], то есть таких, для которых при каждом значении частоты колебаний отношение амплитуд входного и выходного сигналов не зависит от амплитуды входного сигнала. Для тестирования нейрогенной вазоконстрикторной системы на линейность мы проводили раздражение нервов в "синусоидальном" режиме при разных значениях амплитуды модулирующей синусоиды.

Пример такого эксперимента приведен на рис. 4. В данном случае опыт ставился на брыжеечной артерии. Частота стимуляции изменялась по синусоидальному закону на 30% (А) или 70% (Б) от среднего уровня, который в этом опыте составлял 4 Гц. Видно, что более чем двукратное увеличение амплитуды модулирующей синусоиды сопровождается приблизительно таким же повышением амплитуды колебаний потока через сосуд.

Рисунок 4. Пример эксперимента на брыжеечной артерии, в котором частота стимуляции изменялась по синусоидальному закону. Амплитуда модулирующей синусоиды составляла 30% (А) и 70% (Б) от среднего уровня, равного 4 Гц. На обеих записях (А и Б) приведены три отрезка, соответствующие разным значениям частоты модулирующей синусоиды (значения частоты указаны цифрами под кривыми частоты стимуляции).

Заключение

Таким образом, нами разработана методика регистрации сосудодвигательных реакций in vitro при стимуляции интрамуральных нервов. Принципиально важными особенностями методики являются: (1) возможность раздражения симпатических нервов любой заданной последовательностью импульсов и (2) адекватность условий сокращения гладкой мышцы условиям в живом организме. Это дает возможность экспериментального моделирования процессов передачи управляющих нейрогенных сигналов в вазоконстрикторные реакции при регуляции сосудистого тонуса in vivo. Следует отметить, что для этой цели в качестве паттернов стимулирующих импульсов можно использовать и природные последовательности симпатических разрядов, полученные при регистрации нейрограмм. Актуальность таких исследований, в частности, связана с изучением мультимедиаторных характеристик симпатических нейронов. В симпатических нейронах, иннервирующих кровеносные сосуды, медиаторами являются три вещества: норадреналин, нейропептид Y и аденозинтрифосфат [2, 3]. При разных паттернах стимулирующих импульсов соотношение секретируемых медиаторов и развивающиеся констрикторные ответы заметно различаются [6, 7]. В опытах на бодрствующих крысах нами было показано, что блокирование действия одного из нейромедиаторов приводит к существенному изменению частотных характеристик флуктуаций артериального давления, опосредованных влиянием симпатической нервной системы [4, 9]. Поэтому в опытах с раздражением интрамуральных нервов последовательностями импульсов, соответствующими различным "естественным" вазомоторным разрядам, можно исследовать, действие какого медиатора преобладает при данной сосудистой реакции и каковы частотные характеристики сократительной реакции сосудов, вызыаемой этим медиатором. Это открывает новые возможности для исследования проблемы кодирования нейрогенных сигналов, управляющих сосудистым тонусом.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 98-04-49222, РФФИ 99-04-49634 и NASA NCC 9-39.

Литература

1. J.X.Bao // Acta Physiol. Scand. - 1993. - Suppl. 610. - P.1-58.
2. G.Burnstock // J. Auton. Pharmacol. - 1996. - V.16. - P.295-302.
3. G.Burnstock, C.Kennedy // Circulation Res. - 1985. - V.258. - P.319-330.
4. V.Golubinskaya, O.Tarasova, A.Borovik, I.Rodionov // J. Auton. Nerv. Syst. - 1999 (accepted for publication).
5. M.J.Mulvany, H.Nilsson, N.Nyborg, Z.Mikkelsen // Acta Physiol Scand. - 1982. - V.116. - P.275-283.
6. H.Nilsson, B.Ljung, N.Sjoblom, B.G.Wallin // Acta Physiol. Scand. - 1985. - V.123. - P.303-309.
7. J.Pernow, J.Schwieler, T.Kahan, P.Hjemdahl, J.Oberle, B.G.Wallin, J.M.Lundberg // Am. J. Physiol. - 1989. - V.257. - P.H866-H872.
8. N.Sjo blom-Widfeldt, H.Nilsson // Acta Physiol. Scand. - 1990. - V.138. - P.523-528.
9. O.S.Tarasova, V.O.Golubinskaya, A.N.Kosiakov, A.S.Borovik, E.N.Timin, I.M.Rodionov // J.Auton. Nerv. Syst. - 1998. - V.70. - P.66-70.
10. Y.Tomoki, Y.Harasawa, T.Kubota et al. // Am. J. Physiol. - 1994. - V.266. - P.H720-H729.

Study of isolated vessels response to stimulation of sympathetic nerves

A.S.Borovik, V.O.Golubinskaja, O.S.Tarasova, I.M.Rodionov

Lab of Cybernetics, A.V.Vishnevsky Surgery Institute; Department of Human and Animal Physiology, Faculty of Biology, M.V.Lomonosov Moscow State University

We developed a technique to study the response of isolated and perfused vessels to electrical stimulation of perivascular sympathetic nerves. Vessel perfusion is performed with physiological salt solution in constant pressure regimen. The volume flow rate is recorded by means of transit-time flowmeter (Transonic Systemc Inc.). As experimental objects, rat tail artery, rat saphenous artery, mesenteric small arteries (o.d. upto 300 m m) can be used. These vessels are densely innervated by sympathetic nerves, therefore they develop prominent neurogenic constriction. Principal characteristic of the technique is the possibility of stimulation of the nerves with different patterns of impulses. Original software has been developed for registration and processing of the experimental data as well as to set different patterns of stimulation. This technique provides great scope for investigation of the mechanisms of sympathetic neurotransmission, an important step of the sympathetic vascular control.